3D打印人工肌肉用于肉类类似物的开发：超声辅助大米蛋白与D-木糖糖基化调控的结构和功能变化
3D食品打印（3DFP）能够制造具有可控结构和质地的肉类类似物，这是传统加工难以实现的。因此，适合的食品墨水对于3D打印肉类类似物至关重要，以确保精确挤出、形状保持，以及在烹饪过程中增强质地和色泽发展。鉴于大米蛋白分离物（RPI）固有的低溶解度和有限的功能特性
3D食品打印（3DFP）能够制造具有可控结构和质地的肉类类似物，这是传统加工难以实现的。因此，适合的食品墨水对于3D打印肉类类似物至关重要，以确保精确挤出、形状保持，以及在烹饪过程中增强质地和色泽发展。鉴于大米蛋白分离物（RPI）固有的低溶解度和有限的功能特性，需要化学和物理改性策略来提高其作为食品墨水的适用性。在本研究中，研究人员应用超声辅助糖基化来改善用于3D打印肉类类似物的蛋白质基墨水的结构和功能特性。RPI与D-木糖（Xyl）使用一种24 kHz、额定输出功率500 W的探头式超声处理器，在变化的超声处理时间（UT；0、5、30和50 min）下进行糖基化，以制备RPI-Xyl结合物。超声处理促进了RPI与Xyl之间的糖基化和美拉德反应（Maillard reaction）。通过调整大豆分离蛋白（SPI）、RPI和RPI-Xyl结合物的比例来配制蛋白质基墨水。基于每种墨水的流变学特性，使用响应面法（RSM）优化打印参数，随后制造了3D打印的肌肉样植物蛋白结构作为人工肌肉。人工肌肉的结构和功能特性随UT而变化。RPI-Xyl结合物的美拉德反应有助于人工肌肉在热处理后产生类似肉色的色泽。超声处理改变了糖基化人工肌肉中蛋白质的二级和三级结构。在处理的条件下，UT30增强了烹饪后人工肌肉的蛋白质溶解度和二硫键形成。进一步将3D打印人工肌肉的质构特性与牛肉牛排进行比较。值得注意的是，经过UT30处理的人工肌肉表现出优于牛肉牛排的保水性、硬度、弹性和拉伸强度。相反，过度的超声处理（UT50）诱导了部分蛋白质变性和聚集，从而削弱了人工肌肉的功能特性。总体而言，这些发现表明，超声辅助糖基化是改善3D打印人工肌肉结构和功能性能的有效策略，为开发更逼真、高质量的肉类类似物提供了一种方法。
随着可持续性、动物福利和人类健康问题日益受到关注，消费者对植物基肉类类似物的兴趣显著增加。然而，复制真实肉类的外观、质地和风味，尤其是呈现异质质地、纤维组织和热诱导质量变化的肌肉样结构，是该领域面临的主要挑战。传统挤压加工虽常用于改善肉类类似物质地，但难以再现牛肉的大理石纹外观和多样化的质地特性。3D食品打印（3DFP）通过逐层沉积实现空间控制，为制造具有可控几何形状和复杂纹理的肉类类似物提供了结构设计策略。但实现这一概念的关键在于开发合适的食品墨水，其需具备利于挤出和形状保持的流变学特性，并能在烹饪过程中保持理想质地和色泽变化。大豆分离蛋白（SPI）因其强凝胶形成能力被广泛使用，但其高粘弹性限制了墨水中的适用浓度；大米蛋白分离物（RPI）虽含有二硫键连接的谷蛋白，但溶解度低，功能特性有限。因此，结合SPI的强凝胶能力和结构改性的RPI可能是改善3D打印肉类类似物打印质量和结构性能的有效途径。
非酶糖基化（美拉德反应，Maillard reaction）通过还原糖的羰基与蛋白质游离氨基共价结合，可改善蛋白质热稳定性，其中D-木糖（Xyl）作为低分子量还原糖易与氨基反应。然而，仅靠糖基化可能不足以完全调控可打印肉类类似物系统所需的结构和流变特性。超声（ultrasound）是一种非热物理加工技术，通过声空化、剪切力和局部压力变化改变蛋白质结构，同时水声解产生的自由基可氧化游离巯基并改变球状蛋白质分子构象。因此，超声辅助糖基化有望增强RPI与Xyl的反应性，同时调节蛋白质基食品墨水的结构-功能特性。尽管已有研究探索超声辅助糖基化改善植物蛋白功能，但其在3D打印肉类类似物中的应用仍有限，特别是超声辅助糖基化、食品墨水流变学、可打印性及结构化肉类类似物最终质量之间的关系尚未明确。为此，本研究旨在利用超声辅助糖基化制备的RPI-Xyl结合物，开发SPI基墨水，通过3D打印制造肌肉样植物蛋白结构作为人工肌肉，并评估其结构和功能性能。
研究人员假设超声辅助糖基化将修饰RPI-Xyl结合物的结构和功能特性，从而改善人工肌肉的流变行为、可打印性和烹饪质量。他们通过实验证实了这一假设，并发现适当超声处理时间（UT30）下的糖基化人工肌肉在保水性、硬度、弹性和拉伸强度方面优于牛肉牛排。该研究发表在《Ultrasonics Sonochemistry》，为开发更逼真、高质量的肉类类似物提供了有效策略。
本研究主要采用以下关键技术方法：1）超声辅助糖基化：使用探头式超声处理器（24 kHz，500 W），在脉冲模式（开1 min/关1 min）下对RPI与Xyl混合物进行不同时间（0、5、30、50 min）处理，随后95℃加热1 h诱导美拉德反应，制备RPI-Xyl结合物；2）蛋白质基墨水配制：将SPI、RPI及RPI-Xyl结合物按不同比例混合，并加入红色色素和水；3）流变学测量：使用旋转流变仪测定墨水的粘度、屈服应力、储能模量（G′）和损耗模量（G″）；4）响应面法（RSM）优化打印参数：基于面心中心复合设计（FCCD），以流速和打印速度为自变量，打印线宽为响应变量，优化各墨水的打印参数；5）3D打印人工肌肉：使用3D食品打印机（3DFP 1.0）以优化参数打印矩形人工肌肉（40×30×15 mm，1×1网格填充图样）；6）烹饪及特性评价：95℃水浴烹饪1 h；7）结构表征：包括SDS-PAGE、圆二色谱（CD）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、扫描电子显微镜（SEM）；8）理化性质测定：蛋白质溶解度、巯基（-SH）和二硫键（S-S）含量；9）烹饪损失、保水性（WHC）和收缩率测量；10）质构分析：包括质地剖面分析（TPA）、剪切力和拉伸强度。
通过OPA法和420 nm吸光度测量，发现超声处理显著提高了RPI-Xyl结合物的GD和BI值（p
<0.05）。超声空化和剪切应力使rpi球状结构部分展开，暴露更多反应性氨基，从而促进糖基化。ut30和ut50的gd值显著高于ut5和ut0，表明超声加速了美拉德反应产物的形成，但过度超声可能导致蛋白质聚集，降低可及氨基数量。
所有墨水均表现出剪切变稀行为（n值接近-1），且G′显著高于G″，tanδ
<1，表明具有弹性主导的凝胶特性，适合3d打印。添加rpi和rpi-xyl结合物后，稠度指数（k）和屈服应力先升高后降低；spi-rpi墨水k值最高，而spi-rpi-xyl-ut0和ut5墨水k值降低，ut30时回升，ut50时再次下降。超声辅助糖基化有效调节了高蛋白墨水的流变行为，为优化打印参数提供了依据。
RSM分析显示，所有墨水的二阶多项式模型R2>
0.99，p
<0.0001，流速对打印线宽的影响大于打印速度。在固定打印速度10 mm/s下，优化流速使线 mm。打印的人工肌肉尺寸偏差为0.03~1.78 mm，表明高保真度，所有墨水均成功打印出人工肌肉。
烹饪后，牛肉牛排（CONT）出现明显收缩，而人工肌肉保持结构完整。含RPI-Xyl结合物的人工肌肉在烹饪后L*值显著降低，a*值升高，呈现类似肉色的褐变，归因于美拉德反应。MRP（美拉德反应产物）在290 nm和420 nm的吸光度随UT增加而升高，与BI趋势一致，表明超声辅助糖基化促进了色泽发展。
- **粗蛋白和氨基酸组成**：糖基化样品粗蛋白含量为67.50%~69.15%，随UT升高略增。总氨基酸含量显著高于非糖基化样品，特别是精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸和脯氨酸等参与美拉德反应的氨基酸含量随UT变化，其中UT30时半胱氨酸最低，表明其参与二硫键形成。
- **SDS-PAGE**：超声辅助糖基化样品中，天然蛋白条带减弱，并在分离胶顶部出现高分子量条带，表明共价结合物形成。
- **圆二色谱（CD）**：糖基化样品的α-螺旋减少，β-折叠和随机卷曲增加，UT30时随机卷曲比例最高（58.60%），UT50时下降，表明超声诱导蛋白质展开和重折叠。
- **傅里叶变换红外光谱（FT-IR）**：超声辅助糖基化导致酰胺I、II、III区峰位和强度变化，以及3,300 cm?1和1,055 cm?1处峰位蓝移，表明糖分子共价结合到RPI上，增加了羟基数目。
- **扫描电子显微镜（SEM）**：糖基化样品呈现更光滑、致密的多孔网络结构，UT30时结构最连续均一，UT50时变粗糙，表明过度超声破坏凝胶网络。
- **蛋白质溶解度**：糖基化样品溶解度（16.99%~20.25%）显著高于非糖基化样品，UT30时最高（20.25%），UT50时降低至17.17%。超声促进可溶性聚集体形成，改善蛋白质-水相互作用，但过度处理破坏共价键，降低溶解度。
- **巯基和二硫键**：糖基化样品总巯基、游离巯基和二硫键含量均显著高于SPI-RPI样品，UT30时最高，UT50时下降。超声处理暴露了埋藏的巯基，促进二硫键形成，从而增强蛋白质结构稳定性。
CONT的烹饪损失（20.28%）和收缩率（58.02%）显著高于所有人工肌肉（9.39%~13.42%和4.57%~7.79%）。SPI-RPI-Xyl-UT30烹饪损失最低（9.39%），WHC与其他糖基化样品无显著差异，但均高于SPI样品。二硫键交联和致密微结构有效锁住水分。
CONT的硬度低于UT30人工肌肉，但高于其他人工肌肉。糖基化样品的硬度、胶粘性、脆性随UT升高先增后降，UT30时最高（p
<0.05）。弹性、内聚性均显著高于cont。剪切力cont最高，但人工肌肉较低，归因于多孔微结构。拉伸强度在糖基化样品中显著升高，ut30时最高，表明xyl的高反应性形成更强交联网络，增强结构强度。
讨论部分指出，超声辅助糖基化通过调控蛋白质结构（二级、三级结构）和功能（溶解度、二硫键形成），有效改善了3D打印人工肌肉的流变行为、打印精度、色泽、保水性和质构特性。适当超声处理（UT30）促进蛋白质展开和交联，形成致密凝胶网络，使人工肌肉在硬度、弹性、拉伸强度等方面优于牛肉牛排；过度超声（UT50）导致蛋白质变性和聚集，降低功能特性。研究结论翻译如下：
本研究应用超声辅助糖基化修饰了RPI-Xyl结合物，并利用SPI基蛋白质墨水开发了3D打印人工肌肉。在不同超声处理时间下制备的RPI-Xyl结合物被掺入蛋白质基墨水，基于流变特性通过RSM优化了打印参数。在流变参数中，粘度和屈服应力与挤出行为和形状保持密切相关，支持了每种墨水的流速优化。超声处理促进了RPI与Xyl之间的糖基化和美拉德反应，有助于人工肌肉从红色到褐色的热诱导颜色转变。此外，超声辅助糖基化修饰了人工肌肉中蛋白质的二级和三级结构。特别地，UT30增强了蛋白质溶解度和二硫键形成，而过度的超声处理（UT50）则因部分变性和聚集降低了蛋白质功能性。这些结构变化反映在人工肌肉的烹饪质量上。SPI-RPI-Xyl-UT30在保水性、硬度、内聚性、弹性和拉伸强度方面优于CONT。总体而言，本研究表明，超声辅助糖基化可以调节用于3D打印肉类类似物的蛋白质基墨水的结构-功能特性。未来研究需通过掺入人造脂肪及减少烹饪过程中脂肪释放的策略，改善风味相关属性，特别是多汁性。